Lebensmittelanalytik: Sicheres Screening von Sulfonamiden und Chinolonen in Fleisch

Um Menschen vor Keimübertragung durch Fleischverzehr zu schützen, werden erkrankte Tiere in der Nutztierhaltung oft mit Antibiotika behandelt. Diese müssen vor Inverkehrbringen im Körper des Tieres erst vollständig abgebaut werden, um mögliche Gesundheitsrisiken für den Menschen zu vermeiden. Neben Schnelltests oder komplexen Untersuchungen auf Wirkstoffrückstände, gibt es als Alternative spezialisierte HPLC-Screening-Kits mit vorgefertigten Methoden, die schnell und sicher Rückstände von kontrollierten Substanzen in Fleisch und Fleischprodukten bestimmen.

Risiko Antibiotikaresistenz

Berichte über Medikamentenrückstände in Fleisch begegnen uns immer wieder aufs Neue in der aktuellen Tagespresse und verunsichern die Konsumenten. Alleine in Deutschland wurden im Jahr 2015 über 800 t Antibiotika von tierärztlichen Hausapotheken und Tierärzten ausgegeben, wobei ein großer Anteil im industriellen Nutztierbereich Anwendung gefunden hat. Durch die groß-industrielle Aufzucht und Haltung von Nutztieren, ist es Krankheitserregern einfacher möglich, große Anteile eines Bestandes zu infizieren. Daher werden bei Tieren in Gruppenhaltung oft alle vorsorglich mitbehandelt sobald auch nur ein einzelnes Tier erkrankt, um eine Ausbreitung der Infektion innerhalb der Gruppe zu verhindern.

Durch einen übermäßigen Einsatz von Antibiotika können sich jedoch bei den Tieren Resistenzen bilden. Dabei ist insbesondere die mögliche Ausbreitung von resistenten Keimen ein großes Risiko, auch für die Menschen. Daher begegnen der konventionellen Landwirtschaft immer wieder Vorwürfe, dass Nutztiere wie Geflügel zu großen Mengen Antibiotika oder antimikrobieller Substanzen ausgesetzt werden.

Analyse auf Antibiotikarückstände

Um die Verbraucher vor möglichen gesundheitlichen Auswirkungen zu schützen, dürfen Lebensmittel nur dann in Verkehr gebracht werden, wenn keine Antibiotikarückstände enthalten sind. Wird ein Tier mit einem Arzneimittel behandelt, gibt es je nach Medikament eine gewisse Wartezeit, bevor Lebensmittel von diesem Tier in den Handel gebracht werden dürfen. Dabei ist der jeweilige Produzent gesetzlich verpflichtet, seine Produkte auf Rückstände dieser Medikamente zu überprüfen. Zwischen- und Endkundenhändlern bleibt es allerdings selbst überlassen, ob sie sich auf die Analyse des Inverkehrbringers verlassen oder selbst eigenständige Bestimmungen durchführen.

Schnelltests oder komplexe Untersuchungen

Je nach Analyten reichen die Analysemöglichkeiten zur Sicherung von Lebensmittelqualität von einfachen Schnelltests bis hin zu komplexen Untersuchungen mittels Flüssigchromatographie mit massenspektrometrischer Detektion (LC-MS). Beide Methoden haben ihre Vor- und Nachteile. Während die Schnelltests einfach zu bedienen sind, haben sie ein relativ hohes Risiko von Falschbefunden. Die LC-MS-Analytik hingegen ist sehr genau und zuverlässig, bedarf aber speziell ausgebildeten Fachpersonals und komplexeren Auswertungen. Durch die Globalisierung und die damit veränderten Vertriebs- und Absatzwege ist die Nachfrage nach schnellen und einfachen Screening-Methoden angestiegen.

Alternative: Screening-Kits mit vorgefertigten Methoden

Für viele antimikrobielle Substanzen kann als weitere Alternative auch die Trennung über Flüssigchromatographie (High Performance Liquid Chromatography, HPLC) mit Fluoreszenzdetektion in Betracht gezogen werden. Mit spezialisierten Screening Kits, wie den Food-Analyzer-Systemen von Shimadzu, werden vorgefertigte Methoden zur Probenvorbereitung, chromatographischen Trennung und Datenauswertung mitgeliefert, um auch unerfahrenen Anwendern eine schnelle und sichere Bestimmung von überwachten Tierarzneimitteln zu ermöglichen. Dabei können bis zu 24 synthetische Antibiotika analysiert werden, wie Sulfonamide oder Chinolone in Schweine-, Hühner- und Rindfleischproben.

Sulfonamide sind synthetische Antibiotika, die bei Menschen wie auch in der Veterinärmedizin Anwendung finden. In der Tierzucht sind sie gängig bei Magen-Darm-, Harn- und Atemwegserkrankungen. Chinolone werden unterschieden in Wirkstoffe der ersten und der zweiten Generation. Die Chinolone der ersten Generation waren Antibiotika, die ein enges Wirkspektrum hatten und relativ schlecht resorbiert wurden, daher werden sie heutzutage nur noch selten eingesetzt. Die Chinolone der zweiten Generation werden vor allem bei bereits vorhandenen Resistenzen verabreicht und verfügen über ein verbessertes Wirkungsspektrum und Wirkungsselektivität.

Analyse mit HPLC

Für die Analyse werden jeweils 1 g Geflügel-, Schweine- oder Rindfleisch homogenisiert und in verschiedenen Extraktionsschritten aufgereinigt. Die Probenvorbereitungsschritte wurden dabei so auf die jeweilige Matrix und Analyten angepasst, dass Störungen während der Analyse minimiert werden. Die einzelnen Schritte der Probenvorbereitung sind schematisch in Abb. 1 dargestellt.

Nach den Extraktionsschritten wird der verbleibende Rückstand in einer Acetonitril/Wasser-Mischung wiederaufgenommen und für die HPLC-Analyse verwendet. Die analytischen Trennbedingungen der HPLC sind in Tabelle 1 zusammengefasst. Für die Standardlösungen wurden die zu analysierenden Einzelsubstanzen jeweils als Lösungen mit einer Konzentration von 0,025 mg/l vorbereitet. Für die verwendeten antimikrobiellen Wirkstoffe gilt ein Rückstandshöchstwert von 0,01 mg/kg; die Konzentrationen der Standards wurden also so gewählt, dass die erlaubten Höchstwerte um ein Vierfaches unterschritten wurden.

Im vorliegenden Beispiel wurden Hühner- und Schweinefleischproben verwendet. Dazu wurden zunächst Standardlösungen der zu überwachenden Antibiotika vermessen. Anschließend wurden die Proben sowie Proben mit zugesetztem Standardgemisch analysiert. Die Chromatogramme dieser Trennungen sind in Abb. 2 zusammengefasst.

Nachweis der Chinolone durch Fluoreszenzdetektion

Für die Detektion der verschiedenen Chinolone ist der Nachweis bei verschiedenen Wellenlängen zur Anregung und Emission notwendig. Für die Chinolonstandards 1-8 (Abb. 2) erfolgte die Fluoreszenzdetektion bei einer Anregungswellenlänge von 290 nm und einer Emissionswellenlänge von 495 nm. Diese Verbindungen sind Wirkstoffe einer neueren Generation und unterscheiden sich in ihrer Struktur und damit ihrer Fluoreszenz von der älteren Wirkstoffgeneration. Dieser älteren Generation gehören zum Beispiel die Chinolonstandards 9-11 an, daher werden diese bei einer Anregungswellenlänge von 325 nm und einer Emissionswellenlänge von 365 nm detektiert. Die Piromindinsäure (Standard 12) bildet eine Ausnahme, da hier keine Fluoreszenz vorliegt, daher wird diese zusätzlich über eine UV-Detektion bei 280 nm bestimmt. Mit den in Tabelle 1 angegebenen Trennbedingungen können alle Analyten innerhalb von 22 Minuten getrennt und eluiert werden.

Zur zusätzlichen Absicherung der Identität der Analyten kann nicht nur die Retentionszeit, sondern bei mit dem PDA (Photodiodenarray) detektierten Verbindungen zusätzlich ein qualitativer Vergleich des jeweiligen UV-Spektrums des Peaks gegenüber einer Datenbank erfolgen. Hierbei sind Standardspektren für die Einzelsubstanzen hinterlegt und werden mit dem entsprechenden Peak in der Probe verglichen. Abb. 3 zeigt den Datenbankabgleich für Piromidinsäure zwischen dem Spektrum einer gespiketen Matrixprobe und dem Spektrum aus der Datenbank. Die Übereinstimmung zwischen den beiden Spektren betrug dabei 99,8%, also ein sehr gutes Ergebnis.

Zusammenfassung

Der Analyse von Fleisch und Fleischprodukten auf Antibiotikarückstände kommt aufgrund eines gestiegenen Verbraucherbewusstseins und komplexerer Vertriebswege eine immer wichtigere Funktion zu. Die vorgestellte Methode zur Bestimmung von Sulfonamiden und Chinolonen mittels HPLC mit Fluoreszenzdetektion bietet eine einfache und sichere Alternative zu Schnelltests und LC-MS Analytik. Bis zu 24 kontrollierte Substanzen können in einem Lauf bestimmt werden und zwar mit Nachweis- und Quantifizierungsgrenzen, die die gesetzlichen Grenzwerte um ein Mehrfaches unterschreiten.