Quo Vadis – Omics-Technologien in der Lebensmittelanalytik: Strategien zur Sicherung der Lebensmittelauthentizität

Der Betrug mit Lebensmitteln (engl. Food Fraud) ist eine zunehmend globale Herausforderung auf allen Stufen der Lebensmittelprozesskette. In der Folge ist die Sicherung der Lebensmittelauthentizität einer der maßgeblichen Schwerpunkte in der Lebensmittelanalytik. Hierzu bieten sich, aufgrund ihrer Leistungsfähigkeit im non-targeted Bereich, insbesondere omics-basierte Methoden an.

Lebensmittelfälschungen und Herausforderungen

In den letzten Jahren sorgten vermehrt Pressemeldungen bezüglich einer absichtlichen, profitgetriebenen Verfälschung von Lebensmitteln für Schlagzeilen. Dazu zählen u. a. die Aufdeckung von manipulierten Lebensmitteln in Höhe von 230 Mio. € durch die Opson VI Operationen am Jahresanfang 2017 [1] oder auch der Pferde- bzw. die diversen Gammelfleischskandale. Neben der simplen Falschdeklaration, die bspw. die Angaben einer biologischen oder gentechnikfreien Produktionsweise, das Alter, die Lagerungsweise, Sortenhinweise oder den geographischen Anbauort betreffen, werden Lebensmittel gezielt mit bestimmten Zutaten wie z. B. Farbstoffen maskiert, die einen höheren Qualitätseindruck vermitteln sollen. Zu den am häufigsten gefälschten Lebensmitteln zählen neben Milch, Honig, Fisch und Gewürzen insbesondere Olivenöl. Wie groß die tatsächlichen Gewinnspannen mit gefälschten Lebensmitteln sind, lässt sich derzeit nur erahnen. Insgesamt sollen Schätzungen zufolge ca. 10 % der weltweit gehandelten Lebensmittel betroffen sein [2].

Für Laien sind die Verfälschungen häufig kaum wahrnehmbar und nur mit Hilfe von labor-intensiven Methoden, die darüber hinaus ein hohes Maß an Expertise erfordern, nachweisbar. Der Betrug mit Lebensmitteln fällt auch häufig deshalb nicht auf, weil in der Regel durch den Verzehr keine Gesundheitsgefahr für den Verbraucher entsteht. Dennoch können derartige Fälle nicht ausgeschlossen werden, so wurden in der Vergangenheit bspw. Haselnüsse mit Cashew- und Erdnüssen gestreckt. Für entsprechend prädisponierte Allergiker können solche Manipulationen in lebensbedrohlichen Situationen enden. Neben den Verbrauchern ist häufig auch der Lebensmittelhandel von derartigen Skandalen betroffen, da bei Bekanntwerden das Verbrauchervertrauen in ganze Lebensmittelzweige sinkt. Es ist also nur naheliegend, dass die redlichen Produzenten die Entwicklung entsprechender Gegenmaßnahmen unterstützen. Zudem fordert und fördert der Gesetzgeber entsprechende Vorgehensweisen bspw. durch das Prinzip der Rückverfolgbarkeit, der Pflicht zu Eigenkontrollen, der Einrichtung von nationalen und internationalen Zentren zu Wahrung der Lebensmittelauthentizität, wie sie bspw. für Straßburg und Kulmbach beschlossen wurden sowie durch die Unterstützung diverser Forschungsprojekte - als Beispiel sei hier das Verbundprojekt „Food Profiling“ zu nennen – zur Entwicklung neuer analytischer Methoden.

Omics-Technologien zum Authentizitätsnachweis von Lebensmitteln

Das Suffix -omics bezeichnet die vergleichende Analyse einer vollständigen bzw. nahezu vollständigen zellulären Ebene. In Abhängigkeit der Fragestellungen und entsprechend dem zentralen Dogma der Biochemie, das den Informationsfluss von Geno- zum Phänotyp beschreibt, werden für derartige Verfahren das Genom (Genomics), das Proteom (Proteomics) oder das Metabolom (Metabolomics) herangezogen. Das Transkriptom (Transkriptomics) ist in der Regel nicht Gegenstand derartiger Untersuchungen, da RNA in Lebensmittelmatrices nicht ausreichend stabil ist. Auf dieser Vorgehensweise basierend, sind im Laufe der Zeit weitere Termini, bspw. Isotopolomics also die Analyse von Isotopen und Elementen oder Microbiomics, d.h. die Untersuchung von Mikroorganismen hinzugekommen (Abb. 1) [3].

Für den Nachweis der erwähnten Authentizitätsparameter oder für die Detektion bis dato unbekannter Veränderungen eines Lebensmittels ist es häufig nicht ausreichend, wie bei vielen lebensmittelchemischen Standard-Analysen einzelne, bereits bekannte spezifische Analyte zu bestimmen, sondern in der Regel müssen die erforderlichen Markersubstanzen oder -sequenzen zunächst identifiziert werden. Mit Hilfe von omics-Ansätzen wird deshalb ein hypothesenfreies Screening (non-targeted) durchgeführt und anhand von authentischem Probenmaterial die Unterschiede detektiert. Die Vorgehensweise ähnelt der forensischen Daktyloskopie, doch anstelle von bildlichen Fingerabdrücken werden chemische oder elementare Profile herangezogen und dabei eine Art Barcode (maxi fingerprint) erstellt, der möglichst viele Informationen über ein Lebensmittel beinhaltet.

Je nach Fragestellung ist es notwendig eine oder auch mehrere dieser Ebenen zu analysieren. So eignet sich die Untersuchung des Genoms, also der Gesamtheit der Erbinformation, besonders zum Nachweis von Arten oder Sorten, indem die DNA-Sequenzen unterschiedlicher Organismen miteinander verglichen werden [4,5]. Vorteilhaft hierbei ist die außerordentliche chemische Stabilität der DNA über längere Zeiträume. Anders das Proteom (Gesamtheit aller Proteine) und insbesondere das Metabolom (Gesamtheit aller Stoffwechselprodukte), welche von exogenen Faktoren, die anthropogenen Ursprungs sein können bspw. wenn Pflanzenschutzmittel verwendet wurden und von natürlichen Umweltparametern wie z. B. Sonneneinstrahlung oder Wasserverfügbarkeit, beeinflusst werden können. Insbesondere das Metabolom, welches dem Phänotyp am nächsten steht, weist starke Abhängigkeiten gegenüber derartige Faktoren auf und ist folglich im Besonderen geeignet, um die Herkunft (Abb. 2) oder die Anbauweise von Lebensmitteln mittels massenspektrometrischen oder kernspektroskopischen Plattformen nachvollziehen zu können [3].

Die Untersuchung der Stabilisotopen 12C/13C, 1H/2H, 16O/18O, 14N/15N und 32S/34S hat sich in den letzten Jahren als Goldstandard zur Herkunftsbestimmung und zum Nachweis einer biologischen Anbauweise etabliert. Aber auch die Analyse diverser Elemente vorzugsweise der seltenen Erden hat sich als geeignet herausgestellt. Diese Elemente werden weitestgehend ohne merkliche Diskriminierungseffekte von Pflanzen aufgenommen und spiegeln demnach das Bodenprofil im späteren Lebensmittel wider. Derzeit werden seltene Erden in der Industrie bislang nur geringfügig eingesetzt, sodass von reproduzierbaren Konzentrationen in den Böden auszugehen ist. Es ist allerdings in Betracht zu ziehen, dass einige dieser Elemente zukünftig vermehrt bei der Fertigung von Computerchips benötigt werden und daraus ggf. anthropogene Einflüsse sowie Veränderungen der Bodenprofile resultieren könnten. Weiterhin werden derzeit Forschungen durchgeführt, bei denen die seltenen Erdelemente als Dünger zum Einsatz kommen, sodass auch daraus entsprechende Schwankungen hervorgehen könnten [3].

Von der Entwicklung in die Praxis – Der Blick in die Zukunft

Die Entwicklung immer höher auflösender Analysengeräte und schnellerer Technologien schreitet stetig voran, sodass omics-Strategien zunehmend an Bedeutung gewinnen und immer diffizilere Unterscheidungen - gerade im Hinblick auf geographische Entfernung bzw. Verwandtschaftsgrade - ermöglicht werden.

Für die Durchführung DNA-basierter Verfahren hat sich in den letzten Jahren der Einsatz von Next-Generation-Sequenzierung-Technologien (NGS) durchgesetzt. Während bis vor wenigen Jahren die DNA-Sequenzierung nach Sanger noch als Standardverfahren etabliert war, wurde dieses inzwischen von den NGS-Applikationen abgelöst. Mittels der neuen Technologien kann innerhalb von Stunden bis wenigen Tagen mit minimalem personellem Aufwand ein Datenpool erzeugt werden, der bis vor einigen Jahren aufgrund technologischer Grenzen noch undenkbar war. Die als NGS bezeichneten Verfahren umfassen ca. 20 auf dem Markt verfügbare Gerätetypen (Ion Torrent, Illumina, PacBio SMRT Sequencing etc.), welche deutliche Unterschiede in den Leselängen, Kapazitäten, Fehlerraten, Laufzeiten, Anschaffungs- und Unterhaltungskosten sowie dem Preis pro Experiment aufweisen. In den letzten Jahren sind die Geräte immer empfindlicher, kleiner und auch kostengünstiger geworden. Hierbei ist insbesondere das Nanopore-Sequencing (Oxford Nanopore Technologies, Oxford, UK) als Beispiel zu nennen. Bei dieser Sequenzierungsstrategie werden DNA-Stränge aufgrund ihrer negativen Ladungen durch kleinste Membranporen gezogen. Dabei wird ein Ionenstrom gemessen, der sich abhängig von den DNA-Basen, die unterschiedliche Formen und Größen aufweisen, ändert, sodass anschließend auf die DNA-Sequenz zurückgeschlossen werden kann.

Umfangreiche technische Entwicklungen sind auch für die Analytik des Proteoms und des Metaboloms abzusehen. Dies betrifft bspw. die Einführung von Ultrahochfeld-Magneten für NMR-Applikationen, die Frequenzen von bis zu 1.2 GHZ oder höher erreichen oder die Implementierung zusätzlicher physikalischer Trennprinzipen zur Auftrennung extraktreicher Matrices wie die Ionenmobilitätsspektroskopie (Abb. 3) sowie zweidimensionale Trennmethoden (LCxLC, GCxGC), die gekoppelt mit massenspektrometrischen Detektoren eine höhere analytische Abdeckung des Metaboloms erzielen können. Denn zum derzeitigen Zeitpunkt wird das Metabolitspektrum in einer einzigen Pflanze auf bis zu 25.000 unterschiedliche Verbindungen geschätzt, bisher gibt es jedoch keine analytischen Plattformen, die diese wirklich allumfassend analysieren können, da die Substanzen chemisch und physikalisch sehr divers sind. Durch die Anwendung sensitiverer analytischer Applikationen kann folglich eine Vielzahl an zusätzlichen Informationen gewonnen werden.

Bislang sind non-targeted basierte omics-Anwendungen in der Praxis von Untersuchungsämtern und Handelslaboratorien noch nicht sehr weit verbreitet. Ausnahmen sind kommerzielle NMR-Plattformen der Firma Bruker wie der „Wine- oder Juice Screener“. Dieser Umstand liegt unteranderen daran, dass für die benötigten Geräte relativ hohe Anschaffungs- und Instandhaltungskosten aufgebracht werden müssen. Es ist jedoch davon auszugehen, dass bei einem vermehrten Einsatz dieser Techniken in absehbarer Zeit die Investitionskosten sinken. Dieser Trend zeichnet sich bereits bei den Bestrebungen zur Einrichtung der oben genannten Referenzzentren ab.

Ein bisher nur in Ansätzen gelöstes Problem ist der Umgang mit den enormen Datenmengen, die bei non-targeted Ansätzen entstehen können, da diesbezüglich entsprechende Infrastrukturen, Rechenkapazitäten, Softwaresysteme und Speichermöglichkeiten benötigt werden. Immer öfter arbeiten aufgrund dessen neben klassisch ausgebildeten Chemikern bzw. Lebensmittelchemikern auch Bioinformatiker bei der Entwicklung neuer omics-Methoden mit und leisten auf diese Weise einen wertvollen Beitrag. Auch der Umgang bezüglich der Daten zur Erstellung von Datenbanken bedarf noch einiges an Entwicklungsarbeit. Dies liegt u.a. daran, dass es bisher kaum standardisierte Prozesse bei der Methodenentwicklung gibt und die Vergleichbarkeit der Daten zwischen verschiedenen Laboren und Forschungseinrichtungen nur ansatzweise gegeben ist.

Neben dem Einsatz höher auflösender Technologien, lässt sich aber auch ein gegenläufiger Trend hin zu Miniaturisierung und Parallelisierung beobachten. Derartige Anwendungen basieren häufig ebenfalls auf omics-Ansätzen, sollen aber vor allem eine kostengünstige und schnelle Analyse im besten Fall direkt vor-Ort ermöglichen. Für die Ansätze werden non-targeted Methoden stark vereinfacht und auf targeted-Technologien reduziert, mit denen gezielt die zuvor identifizierten Unterschiede detektiert werden können. Bspw. im Metabolomics-Bereich durch die Entwicklung einfacher MRM-Methoden (multiple reaction monitoring) für Triple-Quadrupol Massenspektrometer, da diese üblicherweise in Laboren der Industrie oder der Überwachung bereits vorhanden sind. Im Gegensatz zu den klassischen PCR-Verfahren, die zum spezifischen Nachweis von DNA-Sequenzen Verwendung finden, werden für isothermale Amplifikationen keine Thermocycler oder spezielle Detektionseinheiten (es kann im einfachsten Fall mit bloßem Auge eine Entscheidung getroffen werden) benötigt. Diese Einfachheit ermöglicht einen Einsatz direkt vor Ort. Zunehmende Beliebtheit, aufgrund der möglichen Parallelisierung, erfahren zudem DNA-basierte Chips, welche die simultane Analyse von mehreren tausend Gensequenzen ermöglichen. Die DNA-Chips bestehen aus einem Trägermaterial, das in verschiedene Felder unterteilt ist und auf dem einzelsträngige DNA-Fragmente aufgebracht wurden. Nach der Extraktion und Vervielfältigung der DNA aus der Probe, erfolgt die Aufgabe des Probenextrakts auf den Chip. Die enthaltenen komplementären DNA-Sequenzen des Extraktes binden an die immobilisierten Sequenzen auf dem Chip und erzeugen ein Signal, welches zur Detektion auf der Basis von Fluoreszenz oder Durchlichtmessungen genutzt wird. Protein-Mikroarrays sind analog zu DNA-Microarrays aufgebaut, dienen aber zur Bindung von spezifischen Proteinen oder Substraten mittels Antikörpern und funktionieren in der Regel ähnlich wie ein ELISA (Enzyme-linked Immunosorbent Assay). Lab-on-a-chip-Systeme erlauben die Reduktion ganzer Laboreinheiten auf wenige Quadratzentimeter. Eine Alternative zu den Chips stellen Dipsticks (Stäbchentests [6]) dar, die zwar kein umfangreiches Screening zulassen, aber eine schnelle Ja/Nein-Antwort ermöglichen.

Neben der Reduktion der non-targeted Methoden auf wenige spezifische Marker, ist eine weitere Option die Vereinfachung der Geräte, dabei nimmt allerdings in der Regel auch die Auflösung ab. So sind z. B. inzwischen kleinere Benchtop-NMR-Geräte verfügbar, die einfach im Kofferraum transportiert werden können und für den Betrieb lediglich einen Stromanschluss benötigen. Der Nachteil ist allerdings, dass diese Geräte wegen technischer Grenzen lediglich in Ausführungen von 60-80 MHz gefertigt werden können. Alternativ bieten sich für derartige Einsätze auch Handheld-Geräte an, die bspw. Raman- oder IR-basiert betrieben werden.

Weitere Entwicklungen umfassen die Probenvorbereitung durch den Einsatz von Laser-Ablationssystemen. Anstatt einer aufwändigen Probenvorbereitung wird die Matrix in ein Aerosol umgesetzt, sodass die Proben direkt vermessen und das Ergebnis in wenigen Sekunden erhalten werden kann. Derartige Entwicklungen gibt es inzwischen sowohl für massenspektrometrie-basierte-Systeme zur Analyse von organischen Verbindungen, als auch für die Elementanalyse mittels ICP-MS (Inductively Coupled Plasma - Mass Spectrometry).

Zusammenfassung

Die dargestellten omics-Analysen bieten ein hohes Potential für die Entwicklung lebensmittelchemischer Methoden zur Klärung diffiziler Fragestellungen wie bspw. dem Nachweis der chemischen oder biologischen Identität oder der geographischen Herkunft von Lebensmitteln. Allerdings ist noch einiges an Entwicklungs- und Validierungsarbeit zu leisten, um einen entsprechenden Transfer in Richtung Routineanwendung zu ermöglichen. Dies betrifft insbesondere die Normierung der Verfahren, die Datenverarbeitung sowie die notwendige Vereinfachung der Methoden.

Literatur:
[1]    Europol, Interpol, Operation Opson VI - Report. https://ec.europa.eu/food/sites/food/files/safety/docs/official-controls-food-fraud_Opson-vi-report.pdf, abgerufen am 0.1.07.2018.
[2]    Johnson, R., Food Fraud and “Economically Motivated Adulteration” of Food and Food Ingredients https://fas.org/sgp/crs/misc/R43358.pdf, abgerufen am 01.07.2018.
[3]    Creydt, M.; Fischer, M., Omics approaches for food authentication. Electrophoresis 2018, 39, 1569-1581.
[4]    Schelm, S.; Haase, I.; Fischer, C.; Fischer, M., Development of a Multiplex Real-Time PCR for Determination of Apricot in Marzipan Using the Plexor System. Journal of Agricultural and Food Chemistry 2017, 65, 516-522.
[5]    Herrmann, L.; Haase, I.; Blauhut, M.; Barz, N.; Fischer, M., DNA-Based Differentiation of the Ecuadorian Cocoa Types CCN-51 and Arriba Based on Sequence Differences in the Chloroplast Genome. Journal of Agricultural and Food Chemistry 2014, 62, 12118-12127.
[6]    Fischer, C.; Wessels, H.; Paschke-Kratzin, A.; Fischer, M., Aptamers: Universal capture units for lateral flow applications. Analytical Biochemistry 2017, 522, 53-60.