Säure- und Zuckeranalyse mit einer Dual-Injektion Nexera XR UHPLC

Ein häufig eingesetzter Prozess, um Rohstoffe zu genießbaren und geschmackvollen Lebensmitteln zu verarbeiten, ist die Fermentation. Dabei zerkleinern Mikroorganismen komplexe Inhaltsstoffe und wandeln sie in wichtige Geschmacks- oder Nährstoffe um, sodass sie der menschliche Körper verwerten kann. Doch ist es möglich, die Umsetzung während der Fermentation über bestimmte Ingredienzen messbar zu machen? Eine neue und schnelle Methode in der Hochleistungs-Flüssigchromatographie ((U)HPLC) kann hier helfen, die Umsetzung von organischen Säuren und Zuckern während der Fermentation zu überwachen.

Die Fermentation wird ungefähr seit 5.000 v. Chr. durch die Menschen genutzt, um Lebensmittel zu verarbeiten und haltbarer zu machen. Die Herstellung von Sauerkraut, Kaffee, Bier und Joghurt sind nur einige wenige Beispiele hierfür. Bei diesem biotechnologischen Prozess werden durch mikrobielle und enzymatische Reaktionen organische Stoffe in Säure, Alkohol und Gase umgewandelt. Beispielsweise wird durch die Überführung von Laktose zu Milchsäure der pH-Wert in Lebensmitteln abgesenkt, was deren Haltbarkeit deutlich steigert.

In manchen Fällen reicht es, die Lebensmittel für die Fermentation an der offenen Luft stehen zu lassen, sodass darin enthaltene Bakterien und Mikroorganismen diesen Prozess vorantreiben können. Die industrielle Produktion greift hier jedoch auf Reinkulturen zurück, um die Herstellung kontrollieren und beschleunigen zu können.

Um die Fermentation präzise zu steuern, erfordert es analytische Techniken, mit denen die Umsetzung der organischen Substanzen in die entsprechenden Produkte (Metabolite) überprüfbar ist. Dies kann z. B. durch Hochleistungs-Flüssigchromatographie ((U)HPLC) erfolgen. Typische Trennmechanismen für diese Methoden sind Ionenaustausch-, Ionenausschluss-, Ligandenaustausch- oder Umkehrphasen-Chromatographie.
Für den Nachweis werden je nach Analyten Brechungsindex-, UV- oder Leitfähigkeitsdetektoren eingesetzt. Insbesondere für die Analyse von organischen Säuren ist der Leitfähigkeits- gegenüber dem UV-Detektor deutlich empfindlicher, da ein hoher Untergrund durch Matrixeffekte durch das selektive Detektionsprinzip ausgeblendet wird. Zuckerverbindungen werden hingegen oft mit einer isokratischen UHPLC-Methode und dem Brechungsindexdetektor analysiert.
Zwei neue Methoden für die
Säure- und Zuckeranalyse
Dieser Artikel stellt zwei neue Applikationen vor, mit denen organische Säuren und Zucker in einem Dual-Injektion UHPLC-System von Shimadzu analysiert werden. Beide Methoden haben eine ausreichende Trennleistung für die Substanzklassen und ermöglichen eine schnelle Quantifizierung der Analyten. So eignet sich diese Konfiguration sehr gut für das Monitoring von Fermentationsprozessen, die Zucker abbauen und organische Säuren neu bilden.

Eine applikative Herausforderung sind die stark voneinander abweichenden Trennbedingungen beider Substanzklassen, die bei einer UHPLC-Analyse notwendig sind. Gelöst wird diese Fragestellung mit einer Dual-Injektion Nexera XR UHPLC, die zwei Flusslinien in einem System zusammenfasst (vgl. Fließschema Abb. 1). Besonderer Vorteil bei diesem Instrument ist, dass die identische Probe zeitgleich in die zwei Flusslinien injiziert wird und die Daten in einem Datenfile gespeichert werden. Auf diese Weise werden die Messdaten für die entsprechende Probe zusammengeführt und lassen sich gemeinsam auswerten. Dies verkürzt den Aufwand für die Datenauswertung und ein Vertauschen der Messdaten ist nicht möglich.

Zwei Flusslinien, zwei Detektoren
In der ersten Flusslinie der Dual-Injektion UHPLC werden organische Säuren durch Ionenausschluss-Chromatographie in einer Shim-pack Fast-OA Säule von Shimadzu bei einer Säulenofentemperatur von 40 °C getrennt. Als mobile Phase wird ein p-Toluolsulfonsäure-Puffer eingesetzt. Die Detektion erfolgt über einen Leitfähigkeitsdetektor. Für eine präzise Quantifizierung wird der pH-Wert online zwischen analytischer Säule und Detektor mit einer Pufferlösung aus p-Toluolsulfonsäure, Bisamino-trismethan (Bis-Tris) und EDTA 4H über eine zusätzliche Pumpe von einem sauren auf einen neutralen pH-Wert eingestellt.

Zeitgleich erfolgt die Analyse der Zucker in der zweiten Flusslinie mit Wasser als mobile Phase und Ligandenaustausch-Chromatographie mit einer Shim-pack SCR-101C Säule von Shimadzu. Die Trennung wird bei einer Säulenofentemperatur von 80 °C durchgeführt, gefolgt von einem Nachweis mit Brechungsindexdetektor. Da die Säulenofentemperaturen der beiden Methoden stark voneinander abweichen, werden zwei schmale Säulenöfen verwendet. So wird die Stellfläche einer herkömmlichen UHPLC-Anlage dennoch eingehalten und wertvoller Laborplatz eingespart.

Simultane Analyse
Für die Entwicklung der beiden UHPLC-Methoden wurden Standards mit organischen Säuren (Zitronensäure, Äpfel-, Milch-, Ameisen- und Essigsäure) und Zuckern (Laktose, Glukose, Mannose und Fruktose) eingesetzt und nach Optimierung der Messparameter in Chromatogrammen aufgezeichnet (Abb. 2). Durch die individualisierten Trennbedingungen und die separate Detektion der Analyten werden alle fünf organischen Säuren in unter 8 Minuten getrennt (Abb. 2A), und die vier Zucker weisen innerhalb von zehn Minuten eine ausreichende Trennung auf (Abb. 2B).
Für die Quantifizierung dieser Verbindungen sind Kenngrößen zu berücksichtigen, wie die Wiederholbarkeit der Trennung, die Linearität von Kalibrationskurven und der lineare Messbereich. Für organische Säuren sowie für Zucker wurde eine maximale Retentionszeitschwankung von <0,06 % ermittelt und eine Schwankung der Peakfläche von höchstens 0,6 % (beide n=6). Die externe Kalibration der Substanzen ergab einen linearen Arbeitsbereich von 10 – 1.000 mg/l (organische Säuren) und 10-2.000 mg/l (Zucker) mit einem Bestimmtheitsmaß (R2) von mindestens 0,998.

Fermentations-Monitoring für Joghurt
Die vorgestellte Applikation eignet sich ideal für die Analyse von organischen Säuren und Zuckern bei der Fermentation von Joghurtprodukten. Exemplarisch wurde eine Joghurt-Fermentation bei 40 °C in einem kommerziellen Joghurtbereiter durchgeführt. Die Proben wurden während der Fermentation zu bestimmten Zeiten bei 0, 1, 2, 3,5, 5,5, 7 und 8,5 Stunden gezogen. Die Probenvorbereitung für die HPLC-Analyse gestaltete sich wie folgt:

• 1 g Joghurt wurde in 4 ml einer 5 mmol/l p-Toluolsulfonsäure-Lösung und 1 ml Chloroform extrahiert und für eine Minute durchmischt
• Die Mixtur wurde zentrifugiert (1 min bei 10.000 rpm) und der Überstand filtriert
• Das Filtrat wurde im Verhältnis 1:10 verdünnt und im Anschluss mit UHPLC analysiert.

Abb. 3 zeigt die Chromatogramme für organische Säuren (Abb. 3A) und Zucker (Abb. 3B) nach 3,5 h Fermentationszeit. Die Chromatogramme der reinen Probe sind in schwarz dargestellt. Im Joghurt wurden erwartungsgemäß Zitronensäure, Milchsäure und Laktose in größeren Mengen gefunden. Die Chromatogramme in Rot zeigen die Messergebnisse für eine mit Standard gespikte Probe, mit dem die Wiederfindungsrate bestimmt wurde. Folgende Wiederfindungsraten wurden gemessen: Zitronensäure 99,8 %, Milchsäure 94,6 % und Laktose 102,4 %.
Über die Quantifizierung der organischen Säuren und Zucker im Joghurt wurde abschließend der Fermentationsfortschritt aufgezeichnet. Die Abbildung 3C und D zeigen die gemessene Konzentration von Zitronensäure (orange), Milchsäure (blau) und Zucker (grau) gegenüber dem Fermentationszeitraum. Anhand des blauen Graphen ist der konstante Anstieg der Milchsäuremenge im Joghurt ersichtlich, während der Zuckeranteil im Joghurt stetig abnimmt. So kann mit einer 14-minütigen UHPLC-Messung schnell die Fermentation überwacht und der Produktionsprozess optimiert werden.

Fazit
Innerhalb von nur 14 Minuten ist eine schnelle und parallel verlaufende Analyse von organischen Säuren und Zuckern für das Monitoring von Fermentationsprozessen durchführbar. Die Messungen wurden auf einem Nexera XR Dual-Injektionssystem durchgeführt, das eine simultane Analyse der beiden Substanzklassen ermöglicht. Die Kombination aus einfacher Probenvorbereitung mit wenigen Bearbeitungsschritten und der schnellen Analyse ermöglicht eine präzise Quantifizierung der Analyten. Auf diese Weise lässt sich die Umsetzung von Zuckern und die Entstehung von organischen Säuren einfach überwachen.